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    超微量分光光度計在現代分子生物實(shí)驗室中的運用

    更新時(shí)間:2018-03-12      點(diǎn)擊次數:2213

    超微量分光光度計已經(jīng)成為現代分子生物實(shí)驗室常規儀器,主要設計用于生命科學(xué)實(shí)驗室蛋白質(zhì)組學(xué)和基因組學(xué)下述應用領(lǐng)域:核酸的定量。

    超微量分光光度計

      核酸的定量是超微量分光光度計使用頻率zui高的功能??梢远咳苡诰彌_液的寡核苷酸,單鏈、雙鏈DNA,以及RNA。核酸的zui高吸收峰的吸收波長(cháng)260nm。每種核酸的分子構成不一,因此其換算系數不同。定量不同類(lèi)型的核酸,事先要選擇對應的系數。如:1OD的吸光值分別相當于50μg/ml的dsDNA,37μg/ml的ssDNA,40μg/ml的RNA,30μg/ml的Olig。測試后的吸光值經(jīng)過(guò)上述系數的換算,從而得出相應的樣品濃度。測試前,選擇正確的程序,輸入原液和稀釋液的體積,爾后測試空白液和樣品液。然而,實(shí)驗并非一帆風(fēng)順。讀數不穩定可能是實(shí)驗者zui頭痛的問(wèn)題。靈敏度越高的儀器,表現出的吸光值漂移越大。

      事實(shí)上,超微量分光光度計設計原理和工作原理,允許吸光值在一定范圍內變化,即儀器有一定的準確度和度。另外,還需考慮核酸本身物化性質(zhì)和溶解核酸的緩沖液的pH值,離子濃度等:在測試時(shí),離子濃度太高,也會(huì )導致讀數漂移,因此建議使用pH值一定、離子濃度較低的緩沖液,如TE,可大大穩定讀數。樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素:由于樣品中不可避免存在一些細小的顆粒,尤其是核酸樣品。這些小顆粒的存在干擾測試效果。為了zui大程度減少顆粒對測試結果的影響,要求核酸吸光值至少大于0.1A,吸光值在0.1-1.。在此范圍內,顆粒的干擾相對較小,結果穩定。

      從而意味著(zhù)樣品的濃度不能過(guò)低,或者過(guò)高(超過(guò)光度計的測試范圍)。zui后是操作因素,如混合要充分,否則吸光值太低,甚至出現負值;混合液不能存在氣泡,空白液無(wú)懸浮物,否則讀數漂移劇烈;必須使用相同的比色杯測試空白液和樣品,否則濃度差異太大;換算系數和樣品濃度單位選擇一致;不能采用窗口磨損的比色杯;樣品的體積必須達到比色杯要求的zui小體積等多個(gè)操作事項。

      除了核酸濃度,分光光度計顯示幾個(gè)非常重要的比值表示樣品的純度,如A260/A280的比值,用于評估樣品的純度,因為蛋白的吸收峰是280nm。純凈的樣品,比值大于1.8(DNA)或者2.0(RNA)。如果比值低于1.8或者2.0,表示存在蛋白質(zhì)或者酚類(lèi)物質(zhì)的影響。A230表示樣品中存在一些污染物,如碳水化合物,多肽,苯酚等,較純凈的核酸A260/A230的比值大于2.0。A320檢測溶液的混濁度和其他干擾因子。純樣品,A320一般是0。

      一、蛋白質(zhì)的直接定量(UV法)

      這種方法是在280nm波長(cháng),直接測試蛋白。選擇Warburg公式,光度計可以直接顯示出樣品的濃度,或者是選擇相應的換算方法,將吸光值轉換為樣品濃度。

      蛋白質(zhì)測定過(guò)程非常簡(jiǎn)單,先測試空白液,然后直接測試蛋白質(zhì)。由于緩沖液中存在一些雜質(zhì),一般要消除320nm的“背景”信息,設定此功能“開(kāi)”。與測試核酸類(lèi)似,要求A280的吸光值至少大于0.1A,*的線(xiàn)性范圍在1.0-1.5之間。實(shí)驗中選擇Warburg公式顯示樣品濃度時(shí),發(fā)現讀數“漂移”。這是一個(gè)正常的現象。事實(shí)上,只要觀(guān)察A280的吸光值的變化范圍不超過(guò)1%,表明結果非常穩定。

      漂移的原因是因為Warburg公式吸光值換算成濃度,乘以一定的系數,只要吸光值有少許改變,濃度就會(huì )被放大,從而顯得結果很不穩定。

      蛋白質(zhì)直接定量方法,適合測試較純凈、成分相對單一的蛋白質(zhì)。紫外直接定量法相對于比色法來(lái)說(shuō),速度快,操作簡(jiǎn)單;但是容易受到平行物質(zhì)的干擾,如DNA的干擾;另外敏感度低,要求蛋白的濃度較高。

      二、比色法蛋白質(zhì)定量

      蛋白質(zhì)通常是多種蛋白質(zhì)的化合物,比色法測定的基礎是蛋白質(zhì)構成成分:氨基酸(如酪氨酸,絲氨酸)與外加的顯色基團或者染料反應,產(chǎn)生有色物質(zhì)。有色物質(zhì)的濃度與蛋白質(zhì)反應的氨基酸數目直接相關(guān),從而反應蛋白質(zhì)濃度。

      比色方法一般有BCA,Bradford,Lowry等幾種方法。

      Lowry法:以zui早期的Biuret反應為基礎,并有所改進(jìn)。蛋白質(zhì)與Cu2+反應,產(chǎn)生藍色的反應物。但是與Biuret相比,Lowry法敏感性更高。缺點(diǎn)是需要順序加入幾種不同的反應試劑;反應需要的時(shí)間較長(cháng);容易受到非蛋白物質(zhì)的影響;含EDTA,Tritonx-100,ammoniasulfate等物質(zhì)的蛋白不適合此種方法。

      BCA(Bicinchoninineacidassay)法:這是一種較新的、更敏感的蛋白測試法。要分析的蛋白在堿性溶液里與Cu2+反應產(chǎn)生Cu+,后者與BCA形成螯合物,形成紫色化合物,吸收峰在562nm波長(cháng)。此化合物與蛋白濃度的線(xiàn)性關(guān)系*,反應后形成的化合物非常穩定。相對于Lowry法,操作簡(jiǎn)單,敏感度高。但是與Lowry法相似的是容易受到蛋白質(zhì)之間以及去污劑的干擾。

      Bradford法:這種方法的原理是蛋白質(zhì)與考馬斯亮蘭結合反應,產(chǎn)生的有色化合物吸收峰595nm。其zui大的特點(diǎn)是,敏感度好,是Lowry和BCA兩種測試方法的2倍;操作更簡(jiǎn)單,速度更快;只需要一種反應試劑;化合物可以穩定1小時(shí),方便結果;而且與一系列干擾Lowry,BCA反應的還原劑(如DTT,巰基乙醇)相容。但是對于去污劑依然是敏感的。zui主要的缺點(diǎn)是不同的標準品會(huì )導致同一樣品的結果差異較大,無(wú)可比性。

      某些初次接觸比色法測定的研究者可能為各種比色法測出的結果并不一致,感到迷惑,究竟該相信哪種方法?由于各種方法反應的基團以及顯色基團不一,所以同時(shí)使用幾種方法對同一樣品得出的樣品濃度無(wú)可比性。例如:Keller等測試人奶中的蛋白,結果Lowry,BCA測出的濃度明顯高于Bradford,差異顯著(zhù)。即使是測定同一樣品,同一種比色法選擇的標準樣品不一致,測試后的濃度也不一致。如用Lowry測試細胞勻漿中的蛋白質(zhì),以BSA作標準品,濃度1.34mg/ml,以a球蛋白作標準品,濃度2.64mg/ml。因此,在選擇比色法之前,是參照要測試的樣本的化學(xué)構成,尋找化學(xué)構成類(lèi)似的標準蛋白作標準品。另外,比色法定量蛋白質(zhì),經(jīng)常出現的問(wèn)題是樣品的吸光值太低,導致測出的樣品濃度與實(shí)際的濃度差距較大。關(guān)鍵問(wèn)題是,反應后的顏色是有一定的半衰期,所以每種比色法都列出了反應測試時(shí)間,所有的樣品(包括標準樣品),都必須在此時(shí)間內測試。時(shí)間過(guò)長(cháng),得到的吸光值變小,換算的濃度值降低。除此,反應溫度、溶液PH值等都是影響實(shí)驗的重要原因。此外,非常重要的是,是用塑料的比色法。避免使用石英或者玻璃材質(zhì)的比色杯,因為反應后的顏色會(huì )讓石英或者玻璃著(zhù)色,導致樣品吸光值不準確。

      三、細菌細胞密度(OD600)

      實(shí)驗室確定細菌生長(cháng)密度和生長(cháng)期,多根據經(jīng)驗和目測推斷細菌的生長(cháng)密度。在遇到要求較高的實(shí)驗,需要采用分光光度計準確測定細菌細胞密度。OD600是追蹤液體培養物中微生物生長(cháng)的標準方法。以未加菌液的培養液作為空白液,之后定量培養后的含菌培養液。為了保證正確操作,必須針對每種微生物和每臺儀器用顯微鏡進(jìn)行細胞計數,做出校正曲線(xiàn)。實(shí)驗中偶爾會(huì )出現菌液的OD值出現負值,原因是采用了顯色的培養基,即細菌培養一段時(shí)間后,與培養基反應,發(fā)生變色反應。另外,需要注意的是,測試的樣品不能離心,保持細菌懸浮狀態(tài)。

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